TTC法如何测最低抑菌浓度

TTC法测定最低抑菌浓度（ MIC）的步骤：药液配制及除菌、96孔板准备、抗菌药物二倍稀释、加入菌液、设立对照、培养与观察、MIC值判定。

一、TTC法测定最低抑菌浓度（ MIC）的步骤

1、药液配制及除菌

首先，根据药物的效价或含量及所需体积，准确称取抗菌药物，并使用适宜的溶剂（如PBS缓冲液，根据药物种类选择不同pH值）稀释至所需浓度。抗菌素药物通常通过过滤除菌，而化学合成类药物则可能需结合过滤和高压灭菌处理。

2、96孔板准备

在96孔板的每个孔中加入含TTC的空白肉汤100μl，作为培养基。此步骤确保每个孔中均有相同的起始条件。

3、抗菌药物二倍稀释

在A/B/C三排的第一孔分别加入浓度为512IU/ml或μg/ml的药液100μl，随后进行二倍稀释。即第一孔加药后充分混匀，吸取100μl加入第二孔，再混匀后吸取100μl加入第三孔，以此类推，直至最后一孔。此时，每孔药物浓度从左到右依次为：256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 IU/ml或μg/ml。

4、加入菌液

在每个孔中加入稀释好的菌液100μl，形成测定一个药物MIC值的三次重复（A/B/C三排样品）。每孔的最终药物浓度从左到右依次减半。

5、设立对照

在同一块板的G排设立阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液），H排设立阳性对照（加菌液不加药液），以验证实验条件的有效性。

6、培养与观察

将96孔板放入37度恒温培养箱中培养16～20小时后观察结果。若某孔TTC显示红色，表示有细菌生长；若不变色，则表示细菌被抑制。

7、MIC值判定

横排中未变红色的最后一孔所对应的浓度即为该药物的MIC值。

二、TTC法测量最低抑菌浓度（ MIC）的优势

TTC法利用TTC的氧化还原性质，通过其颜色变化来指示细菌的生长状态。TTC的氧化态是无色的，当细菌存在且生长活跃时，其内部的脱氢酶能将TTC还原为不溶性的红色三苯甲月替（TTF），从而显现出红色。若细菌被药物抑制而无法生长，则TTC保持无色，据此可判断药物的抑菌效果。

1、直观性：通过颜色变化直接判断细菌生长情况，结果易于观察。

2、准确性：采用微量二倍稀释法，能够精确测定MIC值。

3、高效性：可在同一块板上进行多种药物的MIC测定，提高实验效率。

三、TTC法测MIC的实验材料与设备

1、微生物菌株：选择待测的微生物菌株。

2、抗菌物质：需要测定其MIC的抗菌物质。

3、TTC试剂：2,3,5-三苯基氯化四氮唑。

4、培养基：适合微生物生长的培养基。

5、微量移液器：用于精确取液。

6、培养箱：用于微生物培养。

四、TTC法测MIC的注意事项

1、精确稀释：确保抗菌物质的稀释过程精确无误，避免因操作误差影响MIC的测定结果。

2、均匀混合：在将微生物悬液与抗菌物质混合时，要确保混合均匀，避免局部浓度过高或过低。

3、适宜培养条件：根据微生物的生长特性选择合适的培养条件，如温度、pH值等。

4、观察时间：TTC的添加时间和观察时间需要根据实验目的和微生物生长速度来确定，以确保结果的准确性。